全面解析GST 親和層析

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是生物體內(nèi)的一類重要的代謝酶，參與外源和內(nèi)源有毒物質(zhì)的代謝。GST通過催化還原型的谷胱甘肽（GSH）和有毒物質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)，使有毒化合物的水溶性增加從而更容易排出體外，最終達(dá)到解毒的作用。利用這個原理，將GST做成標(biāo)簽表達(dá)出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質(zhì)特異性結(jié)合，從而純化出目標(biāo)蛋白，再用特異性的酶將GST標(biāo)簽切除從而得到天然蛋白。

GST標(biāo)簽是一種常見的標(biāo)簽，它能夠增加外源蛋白的可溶性，很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性，可在不同的宿主中表達(dá)，適應(yīng)范圍廣，能夠提高外源蛋白的穩(wěn)定性，可用不同的蛋白酶去除且具有高特異性，純化方便、溫和。但它也有一定的缺點，比如分子量較大，可能會影響蛋白質(zhì)的功能和下游實驗，因此純化后需要去除標(biāo)簽，并且如果蛋白不可溶，很難用變性的方法純化。

GST親和層析是利用GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價結(jié)合，通過GSH交換洗脫的原理來進行純化。該純化柱中，凝膠手臂上通過硫鍵結(jié)合一個GSH，然后利用其與GST-tag之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標(biāo)簽的融合蛋白能夠與凝膠上的GSH結(jié)合，從而將標(biāo)簽蛋白與其他蛋白分離開。

月旭GST親和層析填料

1.將GST Tanrose 4FF裝入合適的層析柱，層析用5倍柱體積的結(jié)合Buffer進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護蛋白的作用。

2.將樣品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中（保證目的蛋白與GST Tanrose 4FF充分接觸，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3.用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4.使用5-10倍柱體積的洗脫Buffer，收集洗脫液，即目的蛋白組分。

5.依次使用3倍柱體積的結(jié)合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，最后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被細(xì)菌污染。

層析柱：PreCot 5mL GST 4FF；

樣品：重組表達(dá)GST標(biāo)簽蛋白；

結(jié)合緩沖液：20mM PB，150mM NaCl，pH7.4；

洗脫緩沖液：15mM還原型谷胱甘肽，50mM Tris pH8.0。